产品货号：
MT0078
中文名称：
pCold-SUMO原核蛋白表达试剂盒
英文名称：
pCold-SUMO expression system
产品规格：
1盒
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1～3天
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本系统是包涵体蛋白的极佳解决方法，提高蛋白的可溶性优化表达。试剂盒中的原核表达载体pCold-SUMO的启动子(CS Promoter)来源于南极嗜冷细菌，在低温下(15℃)才能启动蛋白的表达。低温下细菌生长缓慢，使得蛋白合成速度减慢，从而最大限度的提高了蛋白正确折叠的几率，提高了蛋白可溶性表达，增强了活性蛋白的表达比率。该表达系统所包含的SUMO-tag可以极大地提高小分子量蛋白的表达量，而且能进一步提高蛋白的可溶表达几率。另外，TEE信号肽可增强冷启动子调控下目的蛋白的高表达。
本试剂盒中的pCold-SUMO载体含有10个组氨酸标签（10*His-tag），具有较强的Ni-NTA结合能力，提高了粗蛋白样品中目标蛋白的捕获能力，从而提高纯化产量。在蛋白纯化过程中可以使用更高浓度的咪唑进行漂洗，去杂蛋白的能力明显提升。从而获得更高纯度的重组蛋白。在重组蛋白酶切去除SUMO标签后，利用Ni-NTA去除SUMO标签更为彻底，获得纯度更高的无标签目标蛋白。
保存：-20℃
关于阳性质粒的使用：
本试剂盒配备的pCold-SUMO Positive Plasmid为蛋白表达阳性质粒，该质粒含有43kD的目标蛋白，其与SUMO标签（19kD）融合后分子量约为62kD。该表达质粒在Arctic (DE3)中即可获得良好的表达。其可以仅可做为表达、酶切实验的阳性对照品。
关于宿主菌的使用：
本试剂盒配备了两种宿主表达菌感受态细胞，Lyophilized Arctic (DE3)感受态和Lyophilized BL21(DE3) Chaprone感受态，两种感受态均为冻干品形式可长期保存在-20℃，效价无明显下降（2～10×105 cfu/μg）。
通常在质粒载体的构建完成，并测序验证后，可将重组质粒转入该感受态进行蛋白表达。该宿主菌仅为蛋白表达生产用，不可以进行载体构建和质粒的提取制备。由于pCold-SUMO系统的高可溶性表达特性，在大多数情况下重组蛋白在Lyophilized Arctic (DE3)感受态即可获得理想的可溶表达，因此首次实验请选用Lyophilized Arctic (DE3)感受态宿主菌。在Lyophilized Arctic (DE3)感受态宿主菌可溶表达效果不理想的情况下，再选用操作相对复杂的、带有辅助折叠伴侣分子的Lyophilized BL21(DE3) Chaprone宿主菌，该系统可获得最佳的可溶表达。除此外，pCold-SUMO系统在常规BL21(DE3)、BL21(DE3)plys等宿主菌内均可获得可观的可溶性表达。
关于蛋白酶的使用：
试剂盒配备了SUMO蛋白酶（酵母来源，也称为UIP蛋白酶）和rTEV蛋白酶，在第一步载体构建过程中需要评估、考虑两个蛋白酶的使用策略。SUMO蛋白酶识别蛋白结构，切割活性高、酶切完全，对于需要去除Tag的重组蛋白其是首选。个别情况下SUMO标签的结构会受到C端重组目标蛋白的影响，使得SUMO蛋白酶对重组融合蛋白的切割效率降低、甚至是无效，此时再选用rTEV蛋白酶进行酶切。由于rTEV蛋白酶识别氨基酸序列，个别重组融合蛋白会包埋识别序列，因此也会导致蛋白酶切效率下降。由于重组融合蛋白结构的无法预测性，因此在实验过程中两种蛋白酶的酶切均需要测试。无论如何，通常SUMO蛋白酶具有更高的效率，是首选。本试剂盒配备的SUMO蛋白酶可以识别SUMO标签结构（SDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG）切割位点位于QIGG之后。SUMO蛋白酶含有双His标签，保证了SUMO蛋白酶高亲和力的结合Ni-NTA，以最大限度的去除SUMO蛋白酶（分子量约26kD）。rTEV蛋白酶可以识别SUMO标签后面的Glu-AsnLeu-Tyr-Phe-Gln-Gly (ENLYFQG)氨基酸序列，并在识别位点Gln-Gly(QG)之间进行切割，从而去除SUMO标签。rTEV蛋白酶含有6×His标签（分子量约30kD），可使用Ni-NTA纯化介质去除。
pCold-SUMO载体图谱：
图1.泳道2和3表明使用pET系统表达几乎无可溶性蛋白表达，皆为包涵体；泳道4和5表明使用pCold-SUMO系统于BL21(DE3)菌中，可溶性蛋白表达约占40%；泳道6和7表明使用BL21(DE3)chaprone可进一步提高蛋白的可溶性表达。
泳道M：蛋白Marker.未诱导
泳道2：pET15b系统表达全菌体蛋白
泳道3：pET15b系统表达上清液(可溶蛋白部分)
泳道4：pCold-SUMO表达于BL21(DE3)全菌体蛋白
泳道5：pCold-SUMO表达于BL21(DE3)上清液(可溶蛋白部分)
泳道6：pCold-SUMO表达于BL21(DE3)chaprone全菌体蛋白
泳道7：pCold-SUMO表达于BL21(DE3)chaprone上清液(可溶蛋白部分)
泳道8：使用Ni-NTA Resin纯化SUMO融合蛋白
泳道9：切除SUMO tag后的目的蛋白
图2.分别用2μL和5μL的SUMO蛋白酶（MT0082）对100μg pCold-SUMO Positive Plasmid表达所得对照蛋白进行酶切1h或3h，如图所示。
泳道1：纯化后的含SUMO标签的对照蛋白；
泳道2：2μL SUMO Protease酶切1h产物；
泳道3：5μL SUMO Protease酶切1h产物；
泳道4：2μL SUMO Protease酶切3h产物；
泳道5：5μL SUMO Protease酶切3h产物。
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本试剂盒中的pCold-SUMO载体含有10个组氨酸标签（10*His-tag），具有较强的Ni-NTA结合能力，提高了粗蛋白样品中目标蛋白的捕获能力，从而提高纯化产量。在蛋白纯化过程中可以使用更高浓度的咪唑进行漂洗，去杂蛋白的能力明显提升。从而获得更高纯度的重组蛋白。在重组蛋白酶切去除SUMO标签后，利用Ni-NTA去除SUMO标签更为彻底，获得纯度更高的无标签目标蛋白。
- 冷启动子，低温诱导表达，最大限度地提高蛋白地可溶性。
- 分子伴侣可协助蛋白的正确折叠。
- 可大大的提高蛋白表达量。
- 两种宿主菌和两种蛋白酶可选，使实验方案更加灵活。
| 组分 | 数量 |
| pCold-SUMO Vector (200ng/μL) | 50μL |
| pCold-SUMO Positive Plasmid (20ng/μl) | 20μL |
| SUMO Protease (10U/μL) | 100μL |
| 10×SUMO Buffer | 1mL |
| rTEV Protease (10U/μl) | 100μL |
| 20×rTEV Buffer | 1mL |
| 1700×氯霉素（34mg/mL） | 1mL |
| 200×L-阿拉伯糖（100mg/mL） | 1mL |
| 1000×四环素（2mg/mL） | 1mL |
| E.coli Transfer Reagent | 1.2mL |
| Lyophilized Arctic (DE3) competent cells | 5支 |
| Lyophilized BL21(DE3)Chaprone competent cells | 5支 |
保存：-20℃
关于阳性质粒的使用：
本试剂盒配备的pCold-SUMO Positive Plasmid为蛋白表达阳性质粒，该质粒含有43kD的目标蛋白，其与SUMO标签（19kD）融合后分子量约为62kD。该表达质粒在Arctic (DE3)中即可获得良好的表达。其可以仅可做为表达、酶切实验的阳性对照品。
关于宿主菌的使用：
本试剂盒配备了两种宿主表达菌感受态细胞，Lyophilized Arctic (DE3)感受态和Lyophilized BL21(DE3) Chaprone感受态，两种感受态均为冻干品形式可长期保存在-20℃，效价无明显下降（2～10×105 cfu/μg）。
通常在质粒载体的构建完成，并测序验证后，可将重组质粒转入该感受态进行蛋白表达。该宿主菌仅为蛋白表达生产用，不可以进行载体构建和质粒的提取制备。由于pCold-SUMO系统的高可溶性表达特性，在大多数情况下重组蛋白在Lyophilized Arctic (DE3)感受态即可获得理想的可溶表达，因此首次实验请选用Lyophilized Arctic (DE3)感受态宿主菌。在Lyophilized Arctic (DE3)感受态宿主菌可溶表达效果不理想的情况下，再选用操作相对复杂的、带有辅助折叠伴侣分子的Lyophilized BL21(DE3) Chaprone宿主菌，该系统可获得最佳的可溶表达。除此外，pCold-SUMO系统在常规BL21(DE3)、BL21(DE3)plys等宿主菌内均可获得可观的可溶性表达。
关于蛋白酶的使用：
试剂盒配备了SUMO蛋白酶（酵母来源，也称为UIP蛋白酶）和rTEV蛋白酶，在第一步载体构建过程中需要评估、考虑两个蛋白酶的使用策略。SUMO蛋白酶识别蛋白结构，切割活性高、酶切完全，对于需要去除Tag的重组蛋白其是首选。个别情况下SUMO标签的结构会受到C端重组目标蛋白的影响，使得SUMO蛋白酶对重组融合蛋白的切割效率降低、甚至是无效，此时再选用rTEV蛋白酶进行酶切。由于rTEV蛋白酶识别氨基酸序列，个别重组融合蛋白会包埋识别序列，因此也会导致蛋白酶切效率下降。由于重组融合蛋白结构的无法预测性，因此在实验过程中两种蛋白酶的酶切均需要测试。无论如何，通常SUMO蛋白酶具有更高的效率，是首选。本试剂盒配备的SUMO蛋白酶可以识别SUMO标签结构（SDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG）切割位点位于QIGG之后。SUMO蛋白酶含有双His标签，保证了SUMO蛋白酶高亲和力的结合Ni-NTA，以最大限度的去除SUMO蛋白酶（分子量约26kD）。rTEV蛋白酶可以识别SUMO标签后面的Glu-AsnLeu-Tyr-Phe-Gln-Gly (ENLYFQG)氨基酸序列，并在识别位点Gln-Gly(QG)之间进行切割，从而去除SUMO标签。rTEV蛋白酶含有6×His标签（分子量约30kD），可使用Ni-NTA纯化介质去除。
pCold-SUMO载体图谱：
图1.泳道2和3表明使用pET系统表达几乎无可溶性蛋白表达，皆为包涵体；泳道4和5表明使用pCold-SUMO系统于BL21(DE3)菌中，可溶性蛋白表达约占40%；泳道6和7表明使用BL21(DE3)chaprone可进一步提高蛋白的可溶性表达。
泳道M：蛋白Marker.未诱导
泳道2：pET15b系统表达全菌体蛋白
泳道3：pET15b系统表达上清液(可溶蛋白部分)
泳道4：pCold-SUMO表达于BL21(DE3)全菌体蛋白
泳道5：pCold-SUMO表达于BL21(DE3)上清液(可溶蛋白部分)
泳道6：pCold-SUMO表达于BL21(DE3)chaprone全菌体蛋白
泳道7：pCold-SUMO表达于BL21(DE3)chaprone上清液(可溶蛋白部分)
泳道8：使用Ni-NTA Resin纯化SUMO融合蛋白
泳道9：切除SUMO tag后的目的蛋白
图2.分别用2μL和5μL的SUMO蛋白酶（MT0082）对100μg pCold-SUMO Positive Plasmid表达所得对照蛋白进行酶切1h或3h，如图所示。
泳道1：纯化后的含SUMO标签的对照蛋白；
泳道2：2μL SUMO Protease酶切1h产物；
泳道3：5μL SUMO Protease酶切1h产物；
泳道4：2μL SUMO Protease酶切3h产物；
泳道5：5μL SUMO Protease酶切3h产物。
- 重组质粒构建
可选用经典的内切酶法对质粒进行双酶切后在T4 DNA Ligase的作用下进行连接，或选用Gibson无缝克隆试剂盒（货号：MT0053）法进行载体构建。无论哪种载体构建策略，将连接产物转入DH5α等克隆感受态细胞，通过测序鉴定重组质粒。测序引物：
pCold-SUMO Primer-F:5’-CCCCTGAAGATTTGGACATG-3’
pCold-SUMO Primer-R:5’-TGGCAGGGATCTTAGATTCTG-3’。 - 重组蛋白表达于Lyophilized Arctic (DE3)宿主菌
- 实验前取出Lyophilized Arctic (DE3)感受态细胞放置于冰上，同时冰上融化E.coli Transfer Reagent。向每瓶冻干感受态中加入300μL E.coli Transfer Reagent，并用枪头吹打混合均匀。将溶解后的冻干感受态，分装到10支0.2mL EP管中，每支分装30μL，并保存到-80℃。注意：冻干感受态干粉未溶解的状态下可-20℃长期保存，已经溶解，务必储存在-80℃，可保存6个月，请避免反复冻融。
- 将重组质粒（20～100ng）加入到30μL上述分装的感受态细胞中，冰上放置5min。
- 42℃水浴中热激感受态45s，立即置于冰上放置2min。热激完毕后，将感受态细胞转移到，装有450μL LB或SOC培养基的1.5mL EP管中，37℃剧烈振荡培养1h后，涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的平板上，过夜培养。
- 挑选生长良好的菌落，接入LB培养基（含40～100μg/ml氨苄青霉素），37℃剧烈振荡培养至OD600=0.4-0.6。
- 待培养基冷却至15℃后，再静置30min。
- 加入适量IPTG(0.1～1mM),15℃振荡培养12～24h。
- 4000rpm室温离心15min，收集细胞。
- 用重悬液重悬细胞，并置于冰上破碎。
- 破碎后使用SDS-PAGE胶检测蛋白的表达及可溶性表达情况。
- 实验前取出Lyophilized Arctic (DE3)感受态细胞放置于冰上，同时冰上融化E.coli Transfer Reagent。向每瓶冻干感受态中加入300μL E.coli Transfer Reagent，并用枪头吹打混合均匀。将溶解后的冻干感受态，分装到10支0.2mL EP管中，每支分装30μL，并保存到-80℃。注意：冻干感受态干粉未溶解的状态下可-20℃长期保存，已经溶解，务必储存在-80℃，可保存6个月，请避免反复冻融。
- 重组蛋白表达于Lyophilized BL21(DE3)Chaprone宿主菌
- 实验前取出Lyophilized BL21(DE3)Chaprone感受态细胞放置于冰上，同时冰上融化E.coli Transfer Reagent。向每瓶冻干感受态中加入300μL E.coli Transfer Reagent，并用枪头吹打混合均匀。将溶解后的冻干感受态，分装到10支0.2mL EP管中，每支分装30μL，并保存到-80℃。注意：冻干感受态干粉未溶解的状态下可-20℃长期保存，已经溶解，务必储存在-80℃，可保存6个月，请避免反复冻融。
- 将重组质粒（20～100ng）加入到30μL上述分装的感受态细胞中，冰上放置5min。
- 42℃水浴中热激感受态45s，立即置于冰上放置2min。热激完毕后，将感受态细胞转移到，装有450μL LB或SOC培养基的1.5mL EP管中，37℃剧烈振荡培养1h后，涂布于含100μg/ml氨苄青霉素和20μg/ml氯霉素的平板上，过夜培养。
- 挑选生长良好的菌落，接入LB培养基（含100μg/ml氨苄青霉素，20μg/ml氯霉素），37℃剧烈振荡培养过夜。
- 1/50比例接入新的LB培养基（含100μg/ml氨苄青霉素，20μg/ml氯霉素，0.5mg/ml L-阿拉伯糖）37℃剧烈振荡培养2h（OD600约0.3）。
- 加入终浓度2ng/ml四环素，37℃剧烈振荡培养至OD600约0.5（约2～4h）。
- 待培养基冷却至15℃后，再静置30min。
- 加入适量IPTG(0.1～1mM),15℃振荡培养12～24h。
- 4000rpm室温离心15min，收集细胞。
- 用重悬液重悬细胞，并置于冰上破碎。
- 破碎后使用SDS-PAGE胶检测蛋白的表达及可溶性表达情况。
- 实验前取出Lyophilized BL21(DE3)Chaprone感受态细胞放置于冰上，同时冰上融化E.coli Transfer Reagent。向每瓶冻干感受态中加入300μL E.coli Transfer Reagent，并用枪头吹打混合均匀。将溶解后的冻干感受态，分装到10支0.2mL EP管中，每支分装30μL，并保存到-80℃。注意：冻干感受态干粉未溶解的状态下可-20℃长期保存，已经溶解，务必储存在-80℃，可保存6个月，请避免反复冻融。
- 蛋白纯化(SUMO蛋白酶切)
- 融合SUMO标签的重组蛋白含有10×His标签，重组蛋白可通过His标签蛋白纯化树脂(货号：MT0081)进行纯化。详细的纯化操作步骤请参考我司His标签蛋白纯化树脂(货号：MT0081)说明书。
- 使用SUMO蛋白酶切割融合蛋白
- 在EP管中配制如下反应体系
成分 用量 融合蛋白 50～150μg 10×SUMO Buffer 20μL SUMO蛋白酶(10U/μl) 2～5μL ddH2O Up to 200μL - 混匀上述体系后于30℃孵育，在1、2、4、6小时分别吸出30μL上述反应液，置于单独的EP管中。
- 向上述EP管中加入20μL 2×SDS Loading Buffer，置于-20℃。
- 取30μL样品进行SDA-PAGE分析。
- 在EP管中配制如下反应体系
- 融合SUMO标签的重组蛋白含有10×His标签，重组蛋白可通过His标签蛋白纯化树脂(货号：MT0081)进行纯化。详细的纯化操作步骤请参考我司His标签蛋白纯化树脂(货号：MT0081)说明书。
- 蛋白纯化(rTEV蛋白酶切)
- 融合SUMO标签的重组蛋白含有10×His标签，重组蛋白可通过His标签蛋白纯化树脂(货号：MT0081)进行纯化。详细的纯化操
作步骤请参考我司His标签蛋白纯化树脂(货号：MT0081)说明书。 - 使用rTEV蛋白酶切割融合蛋白
- 在EP管中配制如下反应体系
成分 用量 融合蛋白 50～100μg 20×rTEV Buffer 7.5μL rTEV Protease 1～3μL ddH20 Up to 150μL - 30℃孵育，在1、2、4、6小时分别吸出30μL上述反应液，置于单独的EP管中。
- 向上述EP管中加入30μL 2×SDS Loading Buffer，置于-20℃。
- 样品全部反应完毕后，样品煮沸5min，取30μL进行SDS-PAGE分析。
- 如融合蛋白要求低温处理，可将反应液置于4℃，请延长反应时间，并增加rTEV酶用量。
- 在EP管中配制如下反应体系
- 融合SUMO标签的重组蛋白含有10×His标签，重组蛋白可通过His标签蛋白纯化树脂(货号：MT0081)进行纯化。详细的纯化操
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